Metabolic engineering of the fungal D-galacturonate pathway

Julkaisun otsikon käännös: Mikrosienten D-galakturonaattireitin metabolian muokkaus

Joosu Kuivanen

    Tutkimustuotos: Doctoral ThesisCollection of Articles

    Abstrakti

    Teollinen biotekniikka on yksi tärkeistä teknologioista, jotka mahdollistavat biomassan jalostamisen erilaisiksi lopputuotteiksi. Bioteknologiaa käyttäen biomassasta voidaan biopolttoaineiden lisäksi tuottaa useita eri kemikaaleja hyödyntämällä solujen metaboliareittejä. Osa näistä hyödyllisistä metaboliareiteistä on luonnostaan soluissa. Sen sijaan osa halutuista lopputuotteista ei syntetisoidu luonnostaan tuotto-organismeissa solujen metaboliareittien kautta. Näissä tapauksissa voidaan hyödyntää solujen geneettistä muokkausta, jotta solun metabolia saadaan ohjattua halutun yhdisteen tuottamiseen. Tässä työssä yksi solun metaboliareitti – mikrosienten D-galakturonihapon kataboliareitti – oli geneettisen muokkauksen kohteena ja se ohjattiin haluttujen yhdisteiden tuottoon. D-galakturonihappo on pektiinin pääkomponentti. Pektiini taas on yleinen kasvibiomassan heteropolysakkaridi. Sitrushedelmien ja sokerijuurikkaan prosessoinnista jäljelle jäävät kuori- ja puristusjäte ovat esimerkkejä pektiinipitoisista biomassoista. Nämä jäännösbiomassat ovat usein vajavaisesti hyödynnettyjä. L-galaktonihappo on kemikaali, jota voidaan potentiaalisesti hyödyntää moniin eri tarkoituksiin. Tässä työssä sen bioteknologinen tuotanto osoitettiin ensimmäisen kerran hyödyntäen Aspergillus niger ja Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) -homeita, joista D-galakturonihapporeitin toinen, dehydrataasientsyymiä koodaava geeni oli poistettu. D-galakturonihapporeitin ensimmäisen, D-galakturonihapporeduktaasia koodaavan geenin ekspressointi paransi alkuvaiheen tuottonopeutta A. niger -homeessa. Lisäksi matala pH paransi tuottoa muokatuissa A. niger -kannoissa. Puhtaasta D-galakturonihaposta saavutettiin parhaimmillaan 7–9 g l-1 L-galaktonihapon tuotto saannon ollessa lähellä 100 %. L-galaktonihapon tuoton lisäksi tämän työn tutkimuskohteena oli bioprosessi suoraan pektiinipitoisesta biomassasta L-galaktonihapoksi. Kahta eri bioprosessityyppiä, nestemäistä ja kiinteän tilan kasvatusta, vertailtiin käyttäen muokattuja A. niger -kantoja. L-galaktonihapon loppupitoisuudet ja saannot pektiinipitoisesta biomassasta olivat verrannollisia arvoihin, joita saavutettiin puhtaasta D-galakturonihaposta. Korkein saanto, joka oli lähes 90 % teoreettisesta maksimista, saavutettiin kiinteän tilan prosessissa. Sienien D-galakturonihapon kataboliareitin toinen reaktio on L-galaktonihapon dehydratointi L-galaknonihappodehydrataasientsyymillä. Kyseistä entsyymiä koodaavan geenin deleetio on välttämätön L-galaktonihapon tuoton saavuttamiseksi. Deleetiosta huolimatta saannot (tuotettu L-galaktonihappo per kulutettu D-galakturonihappo) ovat jääneet alle teoreettisen maksimiarvon. Tämän lisäksi toisen D-galakturonihaposta tuotettavan yhdisteen, teollisesti potentiaalisen kemikaalin galaktaarihapon on havaittu katabolisoituvan sen tuottoon muokatuissa A. niger -kannoissa. Tässä työssä hypoteesinä edellä mainittujen yhdisteiden ei-toivotulle katabolialle olivat mahdolliset muiden dehydrataasientsyymien reaktiot. Näin ollen kaikki viisi putatiivista dehydrataasigeeniä A. nigerin genomista ekspressoitiin hiivassa ja niiden proteiinituotteiden dehydrataasiaktiivisuudet karakterisoitiin. Entsyymikarakterisoinnin avulla määritettiin neljän dehydrataasin substraattispesifisyydet, kun taas yksi putatiivisista dehydrataasigeeneistä ei todennäköisimmin koodaa toiminnallista dehydrataasia. GaaB-L-galaktonihappodehydrataasin lisäksi identifioitiin kaksi dehydrataasia, joilla on aktiivisuus D-galaktonihappoa, ja yksi dehydrataasi, jolla on aktiivisuus L-rhamnonihappoa kohtaan. GaaB oli ainoa tutkituista dehydrataaseista, jolla oli aktiivisuus L-galaktonihappoa kohtaan. Yhdelläkään tutkituista dehydrataaseista ei ollut aktiivisuutta limahappoa tai sen laktonimuotoa kohtaan. Näin ollen L-galaktonihapon ja limahapon kataboliaa ei voitu yhdistää tutkittuihin dehydrataaseihin. L-galaktonihappo-5-dehydrogenaasi on bakteereissa esiintyvä entsyymi, joka hapettaa L-galaktonihapon D-tagaturonihapoksi. Tämän entsyymin aktiivisuus on aikaisemmissa tutkimuksessa osoitettu Escherichia coli -bakteerin soluekstraktista. Myöhemmin kyseisen entsyymin ehdotettiin olevan yjjN-geenin koodaama, mutta kyseisessä tutkimuksessa ei karakterisoitu geenin koodaamaa proteiinia. Tässä työssä osoitettiin, että yjjN-geeni koodaa todellakin L-galaktonihappo-5-dehydrogenaasia. Km ja kcat -arvoiksi L-galaktonihappoa kohtaan määritettiin 19,5 mM ja 0,51 s-1. Tämän lisäksi YjjN-entsyymiä hyödynnettiin kolorimetrisessä analyysimenetelmässä L-galaktoni- ja L-gulonihapon pitoisuuksien määrittämiseen. Havaittavien pitoisuuksien alarajaksi määritettiin L-galaktonihapolle 1,65 μM ja L-gulonihapolle 10 μM. L-galaktonihappo voidaan laktonisoida ja edelleen hapettaa L-askorbiinihapoksi (vitamiini C) käyttäen kemiallisia tai biokemiallisia reaktioita. Synteettinen L-askorbiinihappo on laajalti käytössä ravinteena ja säilöntäaineena eri teollisuudenaloilla. Tällä hetkellä käytössä oleva valmistusmenetelmä yhdistää useita kemiallisia ja biokemiallisia vaiheita. Tässä työssä A. niger -home muokattiin tuottamaan L-askorbiinihappoa D-galakturonihaposta. gaaB-geenin poistamisen lisäksi kasvien L-askorbiinihapon synteesireitiltä ekspressoitiin L-galaktono-1,4-laktoni laktonaasia ja L-galaktono-1,4-laktoni dehydrogenaasia koodaavat geenit A. nigerissä. Vaihtoehtoisesti epäspesifi L-gulono-1,4-laktoni laktonaasia koodaava geeni eläinten L-askorbiinihapon synteesireitiltä ekspressoitiin kasviperäisen laktonaasin sijasta. Laktonaasientsyymiaktiivisuutta ei pystytty kuitenkaan havaitsemaan yhdestäkään muokatuista A. niger -kannoista. Tästä huolimatta kannat pystyivät tuottamaan L-askorbiinihappoa puhtaasta D-galakturonihaposta tai sitrushedelmien prosessijäännösbiomassasta. Korkein havaittu L-askorbiinihapon pitoisuus kasvatuksissa oli 170 mg l-1. Pektiinipitoinen biomassa on potentiaalinen uusiutuva raaka-aine kemikaalien tuottamiseksi. Tämä väitöskirja tuo esille uusia tapoja, joilla jäännösbiomassa voidaan hyödyntää entistä tehokkaammin käyttäen teollista bioteknologiaa. Lisäksi väitöskirja laajentaa perusymmärrystä sienien D-galakturonihapon metaboliareitistä ja siitä, kuinka sitä voidaan muokata tuottamaan hyödyllisiä kemikaaleja.
    Julkaisun otsikon käännösMikrosienten D-galakturonaattireitin metabolian muokkaus
    AlkuperäiskieliEnglanti
    PätevyysTohtorintutkinto
    Myöntävä instituutio
    • Aalto-yliopisto
    Valvoja/neuvonantaja
    • Frey, Alexander, Vastuuprofessori
    • Richard, Peter, Ohjaaja, Ulkoinen henkilö
    Kustantaja
    Painoksen ISBN978-951-38-8340-9
    Sähköinen ISBN978-951-38-8341-6
    TilaJulkaistu - 2015
    OKM-julkaisutyyppiG5 Artikkeliväitöskirja

    Sormenjälki

    Sukella tutkimusaiheisiin 'Mikrosienten D-galakturonaattireitin metabolian muokkaus'. Ne muodostavat yhdessä ainutlaatuisen sormenjäljen.

    Siteeraa tätä