Expression of recombinant proteins in Lactococcus lactis – an application in D-tagatose production

Julkaisun otsikon käännös: Rekombinanttiproteiinien tuotto Lactococcus lactis -bakteerissa – sovelluksena D-tagatoosin tuotto

Noora Salonen

Tutkimustuotos: Doctoral ThesisCollection of Articles

Abstrakti

Lactococcus lactis on kaupallisesti houkutteleva isäntä rekombinanttiproteiinien tuotantoon ja sillä on monia mahdollisia sovelluksia esim. elintarvike- ja lääketeollisuudessa. Rekombinanttiproteiinien tuotanto vaatii sopivan tuottosysteemin, ja tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää uusia indusoituvia tuottosysteemejä L. lactis -bakteerille. Lisäksi tutkittiin kehitetyn tuottosysteemin soveltuvuutta D-tagatoosin tuotantoon. D-Tagatoosi on vähäkalorinen makeutusaine, jolla on monia terveyshyötyjä, mutta tuotantokustannukset rajoittavat yhä sen käyttöä. Työssä kehitettiin kaksi uutta proteiinintuottosysteemiä, joista ensimmäinen perustui L. lactis MG1363:n pstF-promoottoriin. Käyttämällä tätä tiukasti säädeltyä fosfaatin puutoksesta indusoituvaa tuottosysteemiä saavutettiin korkeat solunsisäisen β-galaktosidaasin (670 µkat g-1) ja erittyvän α-amylaasin (3,6 µkat l-1) tuottotasot. Toinen proteiinintuottosysteemi perustui L. lactis MG1363:n suolaindusoituvaan BusA promoottoriin ja BusR säätelygeeniin. Suolaindusoituvan tuottosysteemin aikaansaamiseksi BusR geenin tuottotasoa säädettiin mutatoimalla sen promoottorialuetta. Tällä tuottosysteemillä saavutettiin bioreaktorissa 6,0 μkat l-1 α-amylaasiaktiivisuus, mutta ilman tiukkaa säätelyä. Indusoivia aineita ei tarvittu bioreaktorissa kummallakaan tuottosysteemillä. Tiukan säätelyn ja korkeiden tuottotasojen vuoksi fosfaatinpuutoksesta indusoituva tuottosysteemi valittiin Bifidobacterium longum L-arabinoosi-isomeraasin tuottoon. Puhdistettu entsyymi karakterisoitiin, ja se osoittautui aktiiviseksi ja stabiiliksi happamassa pH:ssa (optimi 6,0–6,5) ja optimaalisesti aktiiviseksi 55 °C:ssa. Km-arvot olivat 120 mM ja 590 mM ja Vmax-arvot olivat 42 U mg-1 ja 7,7 U mg-1, L-arabinoosille ja D-galaktoosille. Entsyymi sitoi metallikofaktorit (Mg2+, Ca2+) tiukasti, mutta sen metallintarve katalyyttistä aktiivisuutta varten oli alhainen. Metalli-ioneja, erityisesti Mg2+, tarvittiin kuitenkin stabiilisuuteen korkeissa lämpötiloissa. Entsyymin lupaavista ominaisuuksista ja korkeasta tuottotasosta johtuen tutkittiin L-arabinoosi isomeraasia sisältävien L. lactis -solujen käyttöä D-tagatoosin tuottoon. Optimointikoe osoitti, että korkea pH, lämpötila ja boraattipitoisuus suosivat tuottoa. Boraattipuskurissa saavutettiin lähes kvantitatiivinen (92 %) konversio viiden päivän kuluessa (20 g l-1 D-galaktoosi, 37,5 °C). D-Tagatoosin tuottoa tutkittiin myös 10 päivän prosessissa (300 g l-1 D-galaktoosi, 1.15 M boraatti, 41 °C), jossa alusta vaihdettiin uuteen kerran vuorokaudessa. Näin saatiin D-tagatoosin tuottotasoksi 185 g l-1 vrk-1, mikä vertautuu kirjallisuudessa raportoituihin lukuihin. Lepäävien solujen käytöllä oli stabiloiva vaikutus entsyymiin, sillä tuottavuus ei heikentynyt 10 peräkkäisen panoksen aikana. Tuotantoprosessin kehittämiseksi jatkuvatoimiseksi solut voitaisiin vielä immobilisoida pakattuun bioreaktoriin. Uusien tuottosysteemien kehittäminen elintarvikelaatuisiksi voisi mahdollistaa lisää sovelluksia.
Julkaisun otsikon käännösRekombinanttiproteiinien tuotto Lactococcus lactis -bakteerissa – sovelluksena D-tagatoosin tuotto
AlkuperäiskieliEnglanti
PätevyysTohtorintutkinto
Myöntävä instituutio
  • Aalto-yliopisto
Valvoja/neuvonantaja
  • Frey, Alexander, Vastuuprofessori
  • Nyyssölä, Antti, Ohjaaja
Kustantaja
Painoksen ISBN978-952-64-1533-8
Sähköinen ISBN978-952-64-1534-5
TilaJulkaistu - 2023
OKM-julkaisutyyppiG5 Artikkeliväitöskirja

Tutkimusalat

  • lactococcus lactis
  • rekombinattiproteiinien tuotto
  • D-tagatoosi
  • bifidobacterium longum
  • L-arabinoosi-isomeraasi

Sormenjälki

Sukella tutkimusaiheisiin 'Rekombinanttiproteiinien tuotto Lactococcus lactis -bakteerissa – sovelluksena D-tagatoosin tuotto'. Ne muodostavat yhdessä ainutlaatuisen sormenjäljen.

Siteeraa tätä