Engineering of N-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae

Julkaisun otsikon käännös: N-glykosylaation muokkaus Saccharomyces cerevisiae -hiivassa

Mari A. Piirainen

Tutkimustuotos: Doctoral ThesisCollection of Articles

Abstrakti

N-glykosylaatio on translaation jälkeinen muokkaus, jolla on merkittävä vaikutus terapeuttisten proteiinien ominaisuuksiin. Monet terapeuttiset proteiinit sisältävät N-glykaaneja, ja useimmat niistä tuotetaan käyttäen nisäkässoluviljelmiä. Saccharomyces cerevisiae -hiiva on tuotanto-organismi, jolla on monia etuja nisäkässoluihin verrattuna. Hiivan tuottamat N-glykaanirakenteet eroavat kuitenkin ihmissolujen tuottamista glykaaneista, minkä takia hiivaa ei voida käyttää terapeuttisten glykoproteiinien tuottamiseen. Tämä voitaisiin kuitenkin mahdollistaa muokkaamalla hiivan N-glykosylaatioreittiä geeniteknisesti. Vaikka hiivojen N-glykosylaation muokkaamiseen on kehitetty erilaisia lähestymistapoja, S. cerevisiae -hiivassa terapeuttiseen käyttöön soveltuvaa N-glykosylaatiota ei ole vielä saavutettu. Lisäksi tieto glykosylaation muokkauksen vaikutuksista hiivassa tuotetun proteiinin laatuun ja määrään on puutteellista. Tässä työssä pyritään kehittämään ALG3- ja ALG11-geenien poistoihin perustuvaa glykosylaation-muokkausmenetelmää S. cerevisiae -hiivassa ja ymmärtämään paremmin glykosylaation muokkauksen ja solunsisäisen proteiinin laadunvalvonnan yhteyttä. Glykosylaatioltaan muokatussa Δalg3 Δalg11 S. cerevisiae -kannassa esiintyvän häiritsevän mannosylaation määrää saatiin vähennettyä MNN1-geenin poistolla. Lisäksi ihmisen GnTI- ja GnTII -geenien ilmentämisen optimointi, UDP-GlcNAc-transportterin ilmentäminen ja glukosamiinin lisääminen kasvualustaan paransivat kompleksityyppisten glykaanien muodostumisen tehokkuutta. Myös galaktosyloituja hybridi- ja kompleksityyppisiä glykaaneja onnistuttiin muodostamaan ilmentämällä ihmisen GalTI-entsyymistä ja Schizosaccharomyces pombe -hiivan galaktoosiepimeraasista koostuvaa fuusioproteiinia. Väitöskirjassa tutkittiin myös glykosylaation muokkauksen vaikutusta solunsisäiseen proteiinin laadunvalvontaan. Δalg3 Δalg11 -hiivakannan muodostamasta Man3GlcNAc2-glykaanista puuttuvat solulimakalvoston proteiinien laadunvalvontajärjestelmässä tunnistussignaaleina toimivat rakenteet. Tämän vaikutusta solulimakalvoston proteiinien hajoamisreitin (ERAD) toimintaan tutkittiin seuraamalla hiivassa tuotetun IgG-proteiinin solunsisäistä käsittelyä ERAD-reittiin liittyvien geenien sekä ALG3- ja ALG11-geenien deleetioiden kanssa. Δalg3 Δalg11 -kannassa osa solunsisäisistä IgG-molekyyleistä ohjautui ERAD-hajoamiseen Yos9p- ja Htm1p-proteiineista riippumatta. ERAD-hajoamiseen ohjautumista havaittiin myös ALG3-geenin läsnä ollessa, jolloin Yos9p osallistui ERAD-ohjautumiseen Htm1p-proteiinista riippumatta. Näiden tulosten perusteella N-glykaanien biosynteesireittiä muokattaessa proteiinin ERAD-hajoaminen voi tapahtua myös muuten kuin tunnetulla Htm1p- ja Yos9p-riippuvaisella mekanismilla. Vaikka useita haasteita on vielä ratkaisematta, S. cerevisiae -hiivasta on mahdollista kehittää glykosylaation muokkauksen avulla tuotto-organismi, jota voitaisiin käyttää nisäkässoluviljelmien sijasta N-glykosyloitujen terapeuttisten proteiinien tuotantoon.
Julkaisun otsikon käännösN-glykosylaation muokkaus Saccharomyces cerevisiae -hiivassa
AlkuperäiskieliEnglanti
PätevyysTohtorintutkinto
Myöntävä instituutio
  • Aalto-yliopisto
Valvoja/neuvonantaja
  • Frey, Alexander, Vastuuprofessori
Kustantaja
Painoksen ISBN978-952-64-0702-9
Sähköinen ISBN978-952-64-0703-6
TilaJulkaistu - 2022
OKM-julkaisutyyppiG5 Artikkeliväitöskirja

Tutkimusalat

  • Hiiva
  • N-glykosylaatio
  • glykosylaation muokkaus
  • ERAD
  • ALG3
  • ALG11
  • MNN1
  • GalT

Sormenjälki

Sukella tutkimusaiheisiin 'N-glykosylaation muokkaus Saccharomyces cerevisiae -hiivassa'. Ne muodostavat yhdessä ainutlaatuisen sormenjäljen.

Siteeraa tätä